Föräldrarlös som ung, bor Peter Parker i Queens, New York med sin älskade moster May och farbror Ben. Peter lever livet som en vanlig student, arbetar som fotograf på skoltidningen, längtar efter den vackra Mary Jane Watson och umgås med kompisen Harry Osborn. På en skolresa, där Peter och klassens elever får en vetenskaplig demonstration om spindlar, blir Peter biten av en genetiskt modifierad spindel. Snart upptäcker han att han har ovanliga krafter: han beväpnats med spindelns styrka och smidighet tillsammans med ett skarpt, ESP-liknande "spindelsinne." Peter använder sina krafter först för att tjäna pengar, men inför en tragedi som träffar honom nära hemma när hans farbror Ben dödas svär han att ägna sitt liv åt att bekämpa brott, och tar till hjärtat orden från sin älskade farbror Ben: "Med stor makt följer stort ansvar." Under tiden genomgår megalomaniisk affärsman Norman Osborn, Harrys far, sina egna förändringar. En experimentell formel har gått snett och ökat hans intelligens och styrka men också drivit honom till vansinne. Han är nu Green Goblin, Spider-Mans främsta fiende, som kommer att sätta ung Peter Parkers löfte att bekämpa brott och hjälpa oskyldiga människor på den ultimata testen.