Oorphaned op jonge leeftijd woont Peter Parker in Queens, New York, bij zijn geliefde tante May en oom Ben. Peter leeft het leven van een normale student, werkt als fotograaf bij de schoolkrant, verlangt naar de mooie Mary Jane Watson en hangt rond met vriend Harry Osborn. Tijdens een schoolreis, waarop Peter en zijn klasgenoten een wetenschappelijke demonstratie over arachniden krijgen, wordt Peter gebeten door een genetisch gewijzigde spinder. Al snel ontdekt hij dat hij ongebruikelijke krachten heeft: hij beschikt over de kracht en behendigheid van een spin, samen met een scherpe, ESP-achtige "spider-sense." Peter gebruikt zijn krachten eerst om geld te verdienen, maar bij een tragedie die dicht bij huis raakt wanneer zijn oom Ben wordt gedood, zweert hij zijn leven te wijden aan het bestrijden van misdaad, in zijn hart meegaand met de woorden van zijn geliefde oom Ben: "With great power comes great responsibility." Ondertussen ondergaat megalomane zakenman Norman Osborn, Harry's vader, zijn eigen veranderingen. Een experimentele formule is misgelopen, waardoor zijn intelligentie en kracht toenemen maar ook waanzin veroorzaken. Hij is nu de Green Goblin, Spider-Man's aartsvijand, die de jeugdige Peter Parkers belofte om misdaad te bestrijden en onschuldige mensen te helpen op de ultieme proef zal stellen.