foreldreløs i ung alder bor Peter Parker i Queens, New York sammen med sin kjærlige tante May og onkel Ben. Peter lever et vanlig studentliv, arbeider som fotograf ved skoleavisen, lengter etter den vakre Mary Jane Watson og tilbringer tid med vennen Harry Osborn. På en skoleutflukt, hvor Peter og klassekameratene får en vitenskapsdemonstrasjon om arachnider, blir Peter bitt av en genetisk endret edderkopp. Siden oppdager han at han har uvanlige krefter: han er utrustet med edderkoppens styrke og smidighet samt en skarp, ESP-lignende "edderkopp-sans". Peter bruker først kreftene sine for å tjene penger, men i møte med en tragedie som treffer nært hjemme når onkel Ben blir drept, lover han å vie livet sitt til å bekjempe kriminalitet, og tar til seg onkel Bens ord med hjertet: "Med stor makt følger stort ansvar." I mellomtiden gjennomgår mektig forretningsmannen Norman Osborn, Harrys far, egne forandringer. En eksperimentell formel har gått galt, og øker hans intelligens og styrke, men driver også ham til vanvidd. Han er nå Green Goblin, Spider-Mans hovedfiende, som vil sette unge Peter Parkers løfte om å bekjempe kriminalitet og hjelpe uskyldige mennesker på den ultimate prøven.